Proveniente da una famosissima famiglia di attori, esordì sulle scene in tenera età accanto ai genitori, per poi diventare un protagonista a Broadway intorno al 1900. Dopo un breve intervallo, durante il quale studiò disegno a Parigi, tornò al teatro nel 1907 ed esordì nel cinema alla Biograph in The Battle (1911). Lionel Barrymore rimase a Broadway fino all'inizio degli anni '20 (massimo successo The Copperhead di Thomas, 1918), fin quando un disastroso Macbeth (1921) non lo convinse a trasferirsi definitivamente a Hollywood. Nel cinema passò con eleganza e maestria da ruoli di protagonista a parti di caratterista. Fra le pellicole più importanti a cui prese parte ricordiamo: The New York Hat (Il cappello di paglia di Parigi, 1912), A Free Soul (Io amo, 1931), per il quale si aggiudicò un meritatissimo premio Oscar, Mata Hari (Mata Hari, 1931), Grand Hotel (Grand Hotel, 1932), The Devil-Doll (La bambola del diavolo, 1936) e You Can't Take It with You (L'eterna illusione, 1938). A differenza del fratello John, che incarnava prevalentemente ruoli romantici, Lionel ha avuto nel corso di una lunga carriera la possibilità di variare i personaggi, rappresentando sullo schermo uomini autoritari, affaristi crudeli o viziosi, cittadini comuni deboli o sopraffatti da un destino avverso, burberi patriarchi: una galleria di figure che via via si adeguava al passare degli anni dell'attore. Una volta sola Lionel apparve insieme ai fratelli, John e Ethel, in un film; si trattava di Rasputin and the Empress (Rasputin e l'imperatrice, 1932). Resta famosa inoltre la sua partecipazione nel ruolo del dottor Leonard Gillespie, alla serie cinematografica dedicata al personaggio del dottor Kildare: Young Dr. Kildare (Il giovane dottor Kildare, 1938), Dr. Kildare's Wedding Day (Il dottor Kildare si sposa, 1941), Dr. Gillespie's Criminal Case (Caso di coscienza per il dottor Gillespie, 1943), ecc... Negli ultimi anni di vita, pur paralizzato agli arti inferiori, portò sugli schermi personaggi creati da lui. Il più degno di nota tra i suoi ultimi film fu Duel in the Sun (Duello al sole, 1946), dove fu accanto alla grandissima Lillian Gish, con la quale aveva recitato diversi anni prima.