James Gunn è nato e cresciuto a St. Louis, nel Missouri, in una numerosa famiglia cattolica di origine irlandese. Ha iniziato la sua carriera cinematografica a dodici anni maneggiando una 8 millimetri. Nel suo primo film ha recitato anche il fratello Sean, che sarebbe poi diventato tra i protagonisti della serie TV della Warner Bros. Una mamma per amica.
Mentre frequentava la Columbia University a New York, Gunn ha trovato lavoro come archivista alla Troma Entertainment, famosa casa di produzione di B-movies, dove ha scritto la sceneggiatura di Tromeo & Juliet per 150 dollari. Dopo essere diventato film di culto, nel 1997 Tromeo & Juliet è stato proiettato in tutto il mondo, compreso un anno di proiezioni di mezzanotte a Los Angeles.
Gunn ha lasciato la Troma per scrivere The Specials (insieme a Rob Lowe, Thomas Haden-Church e Jamie Kennedy), film uscito nel 2000 che parla del giorno libero di un gruppo di super-eroi e in cui Gunn ha anche un ruolo da protagonista. Nello stesso anno la casa editrice Bloomsbury Press ha pubblicato un suo romanzo, "The Toy Collector". Acclamato dalla critica, il libro è la storia di un inserviente d'ospedale che spaccia droga per finanziare la sua crescente mania di collezionare giocattoli. Insieme a Lloyd Kaufman ha scritto anche "All I Need to Know About Filmmaking I Learned from the Toxic Avenger" ("Tutto ciò che ho bisogno di sapere sul cinema l'ho imparato dal Vendicatore Tossico"), attualmente alla quinta edizione.
Nel 2002 è uscita la versione cinematografica di Scooby Doo, film che ha incassato 300 milioni di dollari in tutto il mondo e a cui Gunn ha partecipato scrivendo la sceneggiatura.
A marzo del 2004 Gunn è diventato il primo sceneggiatore nella storia del cinema ad avere due film diversi al primo posto della classifica statunitense degli incassi per due weekend consecutivi: l'acclamato remake de L'alba dei morti viventi il 19 marzo 2004 e Scooby Doo 2: Mostri scatenati il 26 marzo 2004.
L'amore di Gunn per il genere comico e quello per il genere horror sono confluiti nella commedia horror Slither, prodotta dalla Universal nel 2006. Gunn ha scritto la sceneggiatura del film, interpretato da Nathan Fillion e Elizabeth Banks, e per la prima volta ha curato anche la regia. Sul sito Rotten Tomatoes il film si trova ancora nella Top Ten dei migliori film horror. La rivista Rue Morgue l'ha nominato Miglior Film Horror del 2006 e James Gunn ha vinto un Saturn Award e un Fangoria Chainsaw Award per il suo lavoro sul film.
Nel 2008 Gunn ha dato vita al primo contenuto originale per Xbox Live producendo sette film comici realizzati da registi horror, tra cui il suo Sparky & Mikaela. Sempre nel 2008 Gunn ha condotto il reality "Scream Queens" per l'emittente VH1 e ha cominciato a scrivere e a dirigere la webserie "James Gunn's PG Porn" per Spike.com, format che vede attori tradizionali e pornostar recitare insieme in alcuni video comici. Il sito ha avuto oltre 20 milioni di clic online, facendo sì che il prodotto diventasse la webserie con i profitti più alti di tutti i tempi. Il format è stato anche ripreso dalla rete televisiva francese Canal + per una serie di grande successo dell'emittente.
Dopo Super (2011), con Rainn Wilson, Ellen Page e Liv Tyler, nel 2012 ha distribuito il suo primo videogioco, "Lollipop Chainsaw", per Xbox e Playstation 3, e due anni dopo ha diretto il primo capitolo di Guardiani della Galassia, seguito nel 2017 da Guardiani della Galassia 2. Nel 2023 tornerà con Guardiani della galassia vol. 3.
Tra le sue regie troviamo anche Suicide Squad e The Suicide Squad - Missione suicida, oltre alla serie Peacemaker. James Gunn vive a Los Angeles con il suo cane, Dr. Wesley Von Spears.