Mostrò fin da giovanissimo un grande talento istrionico, improvvisando scenette nelle botteghe del padre fabbro e del nonno falegname. Esordì a quindici anni come macchiettista nei café-chantant della capitale. Raggiunse la celebrità durante una tournée in America Latina nel 1907 e confermò poi il suo talento sia in spettacoli di varietà, sia nell'interpretazione di commedie proprie e altrui. Personalità originalissima e caustica, in cui la vena popolare e romanesca coesisteva con una cultura d'autodidatta, ha fatto ricordare fra l'altro, a proposito della sua arte irripetibile e imitatissima, Plauto e la Commedia dell'Arte. Più ancora che nelle altrui o proprie commedie "regolari" (l'amaro e ghignante Chicchignola), il suo estro dissacratore rifulse in sketch come "I salamini", "Più stupidi di così si muore". Impietoso ridicolizzatore di miti e di luoghi comuni creò maschere satiriche come "Gastone", parodia del viveur dannunziano, e "Nerone", macchietta nata nel 1918 come parodia della romanità e che finirà per assurgere a satira del regime fascista miti come Faust; fu più o meno inconsapevolmente legato a esperienze del suo tempo (futurismo, ecc...) e insieme in anticipo su di esso (si pensi al suo senso dell'assurdo). Fu consacrato anche a Londra e a Parigi, dove trionfò nel Medico per forza di Molière alla Comédie-Française. Petrolini era famoso per sapere giocare con i significati e le forme del linguaggio, da autentico funambolo delle parole, e fu maestro della mimica. Nel 1913 e nel 1920 aveva partecipato a due film muti: Petrolini disperato per eccesso di buonumore e il lungometraggio drammatico Mentre il pubblico ride. Più tardi riprese l'attività cinematografica in tre film sonori, testimonianza preziosa del suo modo di recitare: Cortile (1930), Medico per forza (1931) e soprattutto Nerone (1930), che comprendeva una raccolta delle sue più tipiche macchiette. Fu anche autore di teatro: Chicchignola (1931) è considerata la sua opera più riuscita. Le sue ultime parole sul letto di morte furono:" Che vergogna morire a cinquant'anni!" (nonostante ne avesse due in più). Comico fino alla fine.